To år efter at den interne uenighed tvang Mystery Inc. til at lukke dørende, kaldes Scooby-Doo og hans snedige detektivvenner Fred, Daphne, Shaggy og Velma hver for sig til Spooky Island for at undersøge en række overnaturlige hændelser i den splinternye forlystelsespark. Ejeren af Spooky Island Emile Mondavarious frygter, at forlystelsesparken er hjemsøgt og prøver af forene de nævenyttige detektiver, så de kan løse mysteriet, før den overnaturlige hemmelighed skræmmer alle gæsterne væk. Scooby og vennerne må overvinde de personlige uoverensstemmelser og glemme alt, hvad de hidtil viste om falske spøgelser og underlige væsner for at opklare sagen, redde sig selv og måske også hele verden.

En maskeret skurk skaber ravage i byen Coolsville med en monstermaskine, der kan genskabe levende udgaver af Mystery Inc.'s tidligere ærkefjender som 10.000 Volt-Genfærdet, Candyfloss-klatten, Skeletmændene og det grufulde Pterodaktylspøgelse. Fred, Daphne, Shaggy, Velma og Scooby-Doo iværksætter en efterforskning af denne epidemi af uhyrer, som får Shaggy og Scooby til at tvivle på deres roller i Mystery Inc. Men da de gerne vil vise deres evner som detektiver, udtænker den evigt sultne duo en hemmelig plan for at løse mysteriet på egen hånd. Kan holdet opklare deres største sag nogensinde?